fiche synoptique : Isolement et caractérisation des bactériophages

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Collecte et prétraitement des échantillons
Sources : Station d’épuration de Messa, Hôpital Centrale de Yaoundé, Centre Hospitalier Universitaire. 
Collecter 450ml environ d’eau usée, à l’aide de bocal stérilisé de 500ml ;
Transporter jusqu’au laboratoire dans une glacière à 25°C environ ;
Stocker toute la nuit à température ambiante ;
Centrifuger le surnageant à 3000 tr/min pendant 10min à l’aide de tubes Falcon de 15ml ;
Filtrer ce surnageant est filtré avec une seringue filtre avec une taille de pores de 0,45µm vers un tube stérile à vis.

Souches et conditions de culture de l’hôte bactérienne
Utiliser les souches sauvages d'E. coli, K. pneumoniae et P. aeruginosa, qui se trouvent sous forme de collections de cultures au laboratoire CEDBCAM-RI ;
Cultiver à 37°C dans du bouillon Luria Berthani.

Enrichissement
Préparer des suspensions bactériennes de 3ml avec un Mc Farland à 5 ; 
Ajouter 5ml de LBB et 1ml de filtrat de phage ;
Incuber 18h à 37°C ;
Ajouter 150µl de chloroforme dans les différentes émulsions ;
Centrifuger à 3000tr/min pendant 20 min ;
Filtrer à l’aide de filtre seringue de 0,45µm ;

Isolement
Transférer 01ml du filtrat de phage actif dans un tube à essai stérile ;
Ajouter 02ml de culture bactérienne en phase logarithmique dans le LBB et bien mélanger ;
Laisser reposer à température ambiante pendant 10min ;
Ajouter 05ml de LBA à 50°C, bien mélanger et verser sur la surface de la plaque de la gélose Luria 2% d’agar ;
Laisser à température ambiante, puis incuber à 37°C pendant 24h.

Purification 
Retirer les plages transparentes de la gélose à l’aide d’embouts de pipettes stériles et introduire dans 01ml de tampon SM ;
Vortexer et centrifuger à 3000tr/min pendant 10minutes ;
Filtrer le surnageant à l’aide de filtres seringues de 0,45µm ;
Conserver à 4°C jusqu’au traitement.
Titrage des phages
Préparer 05 microtubes pour 10-1 à 10-6 dilutions en série ;
Ajouter 900µl de tampon magnésium dans chaque microtube ;
Ajouter 100µl de filtrat de bactériophages dans le tube de 10-1 dilutions ;
Pipetter 100µl de cette première dilution et transférer dans le microtube 10-2 et ainsi de suite ;
Ajouter 100µl de solution diluée et 200µl de bactéries cultivées pendant la nuit, à la gélose LBA et verser sur les plaques ;
Incuber 24h à 37°C ;
Le lendemain, compter les plages de lyses dans chaque plaque et calculer le titre de phage selon la formule : 

C(ufp/ml)=n/(d×v(ml))

Multiplicité Optimale d’Infection (MOI)
Les cultures d'E. coli de la phase de croissance exponentielle seront infectées avec différentes quantités de phages avec un ensemble de dilutions en série à 10 (10/1), 1 (1/1), 0,1 (1/10), 0,01 (1/100)
Préparer une dilution de 1 x 106 UFC/ml de suspension bactérienne dans 100µl de LBB ;
Ajouter 100µl de filtrat de phage dilué ;
Incuber à température ambiante 15 à 30 minutes ;
Ajouter 5µl de LBA à 50°C ;
Inoculer dans chaque boite de gélose LBA l’émulsion ;
Incuber 2h à 37°C et mesurer les titres ;
Déduire la MOI de la dilution dans laquelle l’efficacité d’infection est plus grande.

Courbe de croissance des phages en une seule étape
Tracer la courbe de croissance en une étape en utilisant le MOI des phages pour leur hôte d’isolement.

Test de stabilité de la température
Un titre de 2,7 × 108 à 1 × 109 UFP/ml de lysat de phage sera évalué à l'aide de la méthode de la double couche d'agar après être stocké à 25°C, 37°C, 45°C et 70°C pendant 6 heures pour déterminer la stabilité des bactériophages à différentes températures.

Efficacité de mise en plaque
Calculer le rapport entre le nombre de plaques formées par un phage particulier sur une pelouse bactérienne hôte et le nombre de particules de phage appliquées sur la pelouse.


Etude moléculaire
Extraction du génome : L'isolement de l'ADN du bactériophage est réalisé en ajoutant et 1µL de DNase et 1µL de RNase à 1 ml de bactériophage purifié et en incubant à 37 ° C pendant 30 minutes pour digérer l'ADN et l'ARN bactériens contaminants. L'acide nucléique du phage est extrait en ajoutant 40µL de TBE, 50 µL de Dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 % et 5µL de protéinase K (10 mg/mL) et en incubant le mélange à 37 °C pendant 1 h. Après l'incubation, 700µL de solution phénol-chloroforme-alcool isoamylique (25:24:1) sont ajoutés pour éliminer les matériaux indésirables, et la solution est centrifugée à 13 000 tr/min pendant 5 minutes. De l'alcool à 70% sera ajouté pour précipiter l'ADN ; environ 700µL seront ajoutés au culot et le mélange est à nouveau centrifugé à 12 749 x g pendant 10 min. Le surnageant sera éliminé et le culot est séché. Cinquante microlitres de solution d’eau sans nucléase (NFW) seront ajoutés au culot pour le stockage de l’ADN à 4°C.
PCR multiplex : Les réactions d'amplification PCR sont réalisées dans des volumes de réaction de 20 µl constitués de 2,5 mM de MgCl2, 2,5 mM de tampon PCR, 0,2 mM de désoxynucléotide triphosphate, 1 U d'ADN polymérase Taq, 1,5 µl de chaque amorce, 3 µl d'ADN matrice et la quantité restante d'eau sans nucléases. L'amplification est réalisée en 35 cycles avec une dénaturation initiale à 95°C pendant 2 min suivie d'une étape de dénaturation à 95°C pendant 30 secondes. 
Electrophorèse sur gel d’agarose : Les produits d'ADN amplifiés issus de la PCR spécifique à la famille des phages sont ensuite analysés par électrophorèse sur gel d'agarose pour détecter la présence de l'ADN du phage ciblé. Les échantillons d'ADN sont vérifiés simultanément sur un gel d'agarose à 1% avec une échelle d'ADN avec 0, 3μL de colorant de changement (Loading dye) et un tampon TBE. Les produits en gel sont visualisés sur un illuminateur ultraviolet et imagés avec un système de documentation sur gel (Bio-Rad)

Activité lytique des phages sur les isolats uropathogènes producteurs de BLSE
Cultiver les isolats bactériens sur LBA 24h à 37°C ;
Prendre des colonies jeunes, repiquer sur LBA et réincuber 18h à 37°C ;
Inoculer quelques gouttes de filtrats de chaque suspension de phages purifiés à divers endroits espacés ;
Incuber 8h à 27°C.